На сегодняшний день для проведения исследований в клинической лаборатории необходимы все более и более чувствительные методы. Одним из таких является измерение хемилюминесценции биологических проб. Низкая интенсивность собственной хемилюминесценции и, как следствие невозможность регистрации результатов из-за низкой чувствительности приборов, являлась до недавнего времени самым главным препятствием для внедрения этого метода в массовые исследования. Однако, проводящиеся в этом направлении опыты показали, что метод хемилюминесценции имеет право на существование в присутствии специальных химических веществ - активаторов.
КАК ПРОИСХОДИТ АКТИВАЦИЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
Если собственное свечение биологической пробы является очень слабым, то при активации некоторых соединений оно многократно усиливается, и интенсивности потока становиться достаточной для регистрации ее с помощью специальных флуориметрических детекторов. При этом в пробе могут происходить процессы двух типов: химические или физические.
Химические активаторы хемилюминесценции - это соединения, вступающие в химические реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы, находящиеся в нестабильном возбужденном электронном состоянии. При переходе молекул в свое обычное состояние происходит выброс фотонов и свечение. Хорошо известные представители таких активаторов - это люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин - бис-N-метилакридиний. Под действием окислителя (радикала гидроксила) происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света.
Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс переноса энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор. К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, применяемые при цепном окислении липидов. В настоящее время еще не изучено до конца, какие именно соединения могут быть применены, и в лабораториях, занимающихся проведением данного вида исследований, ведутся работы по их поиску. Оказалось, что некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов обладают способностью многократно усиливать интенсивность такой хемилюминесценции. Самым эффективным активатором оказалось производные кумарина, которые усиливали реакцию хемилюминесценции в 1 500 раз.
ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ АКТИВИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
- Метод обнаружения катализаторов, разлагающих пероксид водорода с образованием свободных радикалов. В микроколичествах пероксид водорода присутствует в организме человека постоянно и является нейтральным веществом. Но стоит ему только вступить в реакцию с ионами некоторых металлов (железа, меди, марганца, хрома), образуется гидроксильный радикал, который может спровоцировать мутации, запустить процессы подавления ферментативной активности или разрушения биологических мембран. Именно поэтому, очень важно контролировать содержание металлов переменной валентности, а также вообще способности биологического материала разлагать перекись водорода с образованием радикалов. Например, у больных инфарктом миокарда в моче можно обнаружить небольшие количества гемосодержащего вещества - миоглобина, который дает яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Таким образом, свечение мочи в присутствии люминола и перекиси водорода может служить одним из показателей прогрессирующего инфаркта миокарда. Также по реакции хемилюминесценции можно судить об эффективности лечения по заживлению ран. В это случае анализируется жидкость, выделяющаяся из раны, и выясняется количество токсичных радикалов в ней. Снижение содержания этих радикалов показывает процесс заживления раны.
- Метод обнаружения фагоцитов и исследование защитных механизмов клеток. Некоторые клетки организма - гранулоциты и моноциты крови и тканевые макрофаги для борьбы с чужеродными клетками выделяют, так называемые, активные формы кислорода (супероксидный радикал - пероксид водорода и радикал гидроксила). При активации этой реакции люминолом регистрируется свечение большой интенсивности. Усиление свечения наблюдается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда или у больных семейной гиперхолестеринемией (при этой наследственной болезни в крови содержится много холестерина и имеется выраженная предрасположенность к раннему развитию атеросклероза).
- Метод определения супермикроколичеств гемоглобина в крови. В основе метода лежит способность производных гемоглобина инициировать фотохимическую реакцию окисления люминола. Интенсивность возникающей хемилюминесценции определяется содержанием гемоглобина в пробе.
Это далеко не полный список примеров, где с помощью хемилюминесцентных методов можно выявлять различные патологии в организме на ранних стадиях.